En dos artículos anteriores, discutimos algunos requisitos para el cultivo exitoso de tejidos de plantas y hongos. Se han mencionado algunas técnicas de laboratorio específicas, pero tal vez no con suficiente detalle para permitir el uso seguro de una buena “técnica estéril”. Este artículo final de la serie tiene como objetivo mejorar eso.

¿Qué es la técnica estéril?

La “técnica estéril” describe los muchos procedimientos que minimizan la introducción de organismos contaminantes en un experimento o cultivo. Esto incluye ropa adecuada, limpiar las superficies de trabajo con desinfectantes, esterilizar en autoclave y dispensar líquidos y sólidos, esterilizar herramientas con desinfectantes o llamas, y seguir la secuencia de trabajo adecuada al transferir entre recipientes de cultivo como matraces, placas de Petri o tubos de ensayo. El trabajo se puede realizar al aire libre, pero las tasas de contaminación se reducen considerablemente si se hace un esfuerzo por limpiar el aire en el área de trabajo. Esto se logra mediante el uso de campanas de cultivo estériles, también llamadas bancos de flujo laminar, campanas de filtro HEPA (aire de partículas de alta eficiencia) o descriptores similares.

Por qué es importante la técnica estéril

Los cultivos de tejidos deben protegerse de la contaminación por parte de los trabajadores del laboratorio. Los seres humanos son una gran fuente de microbios que pueden entrar fácilmente en un matraz o placa de Petri. Por lo tanto, es importante cubrir tanto como sea posible con mangas largas y limpias (se recomiendan batas de laboratorio que nunca salgan del laboratorio), protectores para el cabello y la barba y guantes de goma, preferiblemente de nitrilo. Antes de comenzar a trabajar, lávese las manos enguantadas con alcohol isopropílico al 70 % (isopropanol).

Hay muchos desinfectantes domésticos y de laboratorio disponibles, pero el isopropanol al 70 % es difícil de superar en cuanto a costo, eficacia y seguridad. ¿Por qué el 70%? Un porcentaje más bajo no es tan efectivo. Un porcentaje significativamente mayor causa daño inmediato (coagulación) de las proteínas de la membrana celular, lo que interfiere con la absorción posterior de la solución de alcohol en la célula; El 70% es el camino correcto. Incluso cuando se utiliza una campana de flujo, se recomienda limpiar el área de trabajo con isopropanol al 70 %.

herramientas de esterilización

No hay atajos para esterilizar medios de cultivo líquidos o sólidos. Se requiere un dispositivo capaz de mantener una temperatura de 121 °C a una presión de 103 kilopascales (250 °F a 15 PSI) durante varias horas. La buena noticia es que esto está dentro del rango de ollas a presión estándar/latas y ollas instantáneas. La mayor limitación de un Instant Pot es su volumen. Las ollas a presión eléctricas o de gas están disponibles en tamaños más grandes para operaciones más grandes. En cualquier caso, esterilice los líquidos durante al menos 15 minutos (los volúmenes más grandes tardarán más) con un retorno lento a la presión atmosférica para evitar que hierva. Los sólidos y la cristalería tardan de una a cuatro horas, pero se pueden ventilar a la atmósfera inmediatamente.

Las herramientas manuales incluyen bisturís, hojas de afeitar, cuchillos, espátulas y bucles (Figura 1). Estos pueden limpiarse con isopropanol al 70 % y dejar que se evaporen, o sumergirlos en isopropanol al 95-99 % y pasarlos por una llama. La llama puede ser proporcionada por un dispositivo impresionante como un “Bacti-Cinirator” que esteriliza con radiación infrarroja, o una simple lámpara de alcohol. Los bucles se enfrían relativamente rápido después de flamearlos, pero los elementos más grandes, como las cuchillas, tardan más.

Cómo va

La mayor parte de la habilidad entra en juego cuando se trabaja con cultivos vivos. La mejor manera de aprender a transferir entre placas (placas de Petri), tubos o matraces es observar cómo lo hace otra persona y luego practicar varias veces. No hay sustituto para la capacitación práctica, pero muchos videos de YouTube hacen un buen trabajo al demostrarlo. Aquí hay dos técnicas estándar:

(1) Transferencias de placa a placa. Esterilizar la herramienta. Sosteniendo la herramienta con su mano dominante, use la otra mano para levantar suavemente la cubierta de la placa fuente mientras la mantiene sobre la superficie del medio. Utilice la herramienta para tomar una muestra de la placa y devolver la tapa lo antes posible. Levante la cubierta por encima de la placa de recogida lo suficiente para transferir la muestra de la herramienta a la superficie del medio. Vuelva a colocar la cubierta rápidamente después de que se complete la transferencia. Esterilizar la herramienta.

(2) Transferencias de tubos y matraces. Esterilice la herramienta, a menudo un asa pequeña en estos casos, especialmente con cultivos líquidos. El matraz o tubo tiene una tapa roscada o un tapón. Funciona igual para un tubo o matraz. Sostenga la herramienta en su mano dominante y el tubo en su mano no dominante. Use el dedo meñique de la mano de la herramienta para quitar la tapa o el tapón del tubo y mantenerlo en su lugar (Figura 2). Pase el cuello del tubo a través de una llama. Esto calienta el aire en el cuello y lo empuja hacia afuera. Inserte la herramienta en el tubo para recolectar o dispensar una muestra, vuelva a flamear el cuello y vuelva a colocar el tapón o la tapa. Flamee la herramienta para esterilizarla y déjela enfriar para la siguiente operación.

Kits de cultivo de tejidos para uso doméstico

Muchos considerarían una campana de cultivo estéril como una pieza esencial del equipo de cultivo de tejidos. Desafortunadamente, las unidades comerciales oscilan entre $500 y $2,500, aunque algunos modelos pequeños de escritorio ahora están disponibles por menos de $200. Entonces, la cuestión es que una campana de flujo se puede construir desde cero con relativa facilidad, por mucho menos de la mitad del costo de una preconstruida. La Figura 3 muestra un pequeño dispositivo de sobremesa que consta de un recinto de trabajo de plexiglás y un ventilador adjunto que sopla a través de varias capas de material de filtro MERV 13. La eficiencia del 99,97 % a 0,3 μm no es exactamente la de un filtro HEPA, pero es de alrededor del 95 %, lo que es una mejora significativa con respecto a la ausencia de filtrado. La carcasa está mecanizada a partir de herrajes y barras con ranuras en T de aluminio extruido estándar. Originalmente se construyó para usar un pequeño filtro HEPA de aspiradora comprado en una venta de garaje por un dólar, por lo que el filtro se monta en una pequeña abertura en la parte superior de la caja. no es ideal, pero funciona. Por lo general, desea que el aire sople linealmente de atrás hacia adelante (flujo de aire laminar) para que cualquier partícula en el aire se elimine del área de trabajo con una turbulencia mínima.

En la Figura 4 se muestra un mejor diseño con un filtro HEPA, aunque no tan eficiente en el espacio. Este dispositivo tiene una cámara de madera contrachapada (un recinto que contiene aire a baja presión) para sostener un ventilador de velocidad variable montado en la parte superior. Aquí, también, la zona de trabajo es una carcasa de plexiglás en un marco con ranura en T. La cámara impelente está montada en el filtro y el filtro está montado en la carcasa. Hacer funcionar esta unidad con nueve placas de agar nutritivas expuestas durante media hora dio como resultado una contaminación del 0 %.

Para cualquier persona interesada en el cultivo de tejidos de plantas o hongos, las técnicas que discutimos están cubiertas y demostradas en muchos artículos, libros y sitios web. Así que sigue investigando, consigue equipo y crea el tuyo propio.