No debería sorprender que sea posible propagar y hacer crecer organismos de todos los reinos de la vida directamente a partir de sus tejidos, incluidas plantas, hongos y animales. Los animales representan el mayor desafío, seguidos de las plantas. Las plantas pueden ser más fáciles de cultivar y cuidar en el laboratorio que los hongos o los animales, pero en términos de cultivo de tejidos, los hongos productores de hongos son, con mucho, los más fáciles de trabajar. El medio de cultivo es fácil de hacer, no se requieren hormonas y la mayoría de los hongos crecen bien vegetativamente en un rango de temperatura bastante amplio. La producción de hongos requiere trabajo adicional, pero obtener y mantener el material de partida en un cultivo axénico (no contaminado) es un primer paso necesario.

El reino fúngico es diverso, pero nos centraremos en los hongos basidiomicetos, que se reproducen produciendo esporas en los hongos con cubierta branquial. Prácticamente cualquiera de las especies comestibles comunes, como Agaricus bisporis (champiñones, crimini, portabella), Pleurotus ostreatus (Ostra), Lentinula edodes (Shiitake) y muchos otros se pueden cultivar a partir de los cuerpos fructíferos, los hongos mismos.

prescripción PDA

Gran parte del equipo necesario para cultivar hongos es el mismo que para el cultivo de tejidos vegetales (ver recuadro). Una variedad de medios favorecen el crecimiento de hongos, pero uno de los más fáciles de preparar y más efectivo es el agar papa dextrosa (PDA). Puede comprar PDA listo para usar en forma de polvo (o incluso medios que ya están en placas de Petri), pero la mayoría de los hongos crecen mejor en los caseros. Aquí hay una manera de crear un PDA:

1. Picar 100 g de patatas crudas y hervirlas en 600 ml de agua durante al menos media hora.
2. Dejar enfriar y pasar por un colador fino para eliminar los sólidos.
3. Colocar el extracto en una probeta graduada y completar el volumen a 500 ml. Transferir a un matraz de 1000 ml.
4. Agregue 5 g de dextrosa (glucosa) y 9 g de agar-agar (gelificante) a este caldo de patata.
5. Si lo desea, agregue 0,1-0,5 g de peptona o extracto de levadura (o ambos).
6. Revuelva bien y ajuste el pH a 5,8.
7. Caliente la mezcla en un plato caliente o suavemente en un horno de microondas (no cocine demasiado) para disolver el agar y otros ingredientes.
8. Transfiera el medio bien mezclado a matraces Erlenmeyer más pequeños (no más de la mitad llenos, con las tapas flojas) y esterilice en autoclave (cocción a presión) a 121 °C durante 15 a 20 minutos.
9. No ventile el recipiente a presión; vuelve lentamente a la presión atmosférica.
10. Cuando el medio se haya enfriado hasta cerca de su punto de gel, viértalo rápidamente en placas de Petri utilizando una técnica estéril (p. ej., mantenga la tapa sobre la placa abierta durante el vertido para protegerla de la contaminación desde arriba). Llene cada placa de Petri hasta la mitad o un poco menos.

Si el agar se vierte caliente, habrá mucha condensación en las placas, lo que aumentará la posibilidad de contaminación posterior, por lo tanto, deje que el agar se enfríe hasta cerca de su punto de gel antes de verterlo. Debería ser suficiente para unos 6-10 platos bastante vertidos. Los platos hondos no se secan tan rápido como los poco profundos. Una vez que el agar se ha endurecido, estas placas están listas para usar o se guardan en el refrigerador envueltas en plástico.

conseguir champiñones

Ahora necesitas un hongo. Los micófilos experimentados encontrarán y reconocerán posibles candidatos en sus incursiones en los bosques y campos. Como está más allá del alcance de este artículo describir cómo identificar especies silvestres comestibles, asumimos que tiene en sus manos un hongo que desea propagar. Con fines formativos y educativos, puede probar setas compradas en tiendas, pero tenga en cuenta que los acuerdos de propiedad intelectual y las restricciones asociadas pueden prohibir la reproducción de cepas comerciales.

Empezaremos con el humilde hongo (Figura 1). Primero seleccione un hongo que sea lo más joven y fresco posible sin ningún signo de podredumbre. Si está disponible, trabaje en una campana de flujo laminar con filtro HEPA. De lo contrario, trabaje rápidamente y deje libre el tejido fúngico y la superficie del agar durante el menor tiempo posible. Aquí hay un procedimiento paso a paso:

1. Limpie todas las superficies de trabajo, desinfecte todas las herramientas con alcohol isopropílico al 70 % y tenga varias placas PDA cerca.

2. Use guantes de goma (de preferencia de nitrilo) y lávese las manos enguantadas con isopropanol al 70 %. ¡Nada de mangas cortas! USTED suele ser la mayor fuente de contaminación.

3. Use un bisturí o un cuchillo X-ACTO para hacer una pequeña hendidura en el costado de un sombrero de champiñón entero seleccionado. A veces funciona mejor si haces el corte en la parte inferior del tallo.

4. Utilizando la hendidura como punto de partida, rompa con cuidado el hongo por la mitad, coloque ambas mitades en una placa de Petri y cúbrala con la tapa (Figura 2).

5. Retire la tapa de los champiñones tapados y use un bisturí o cuchillo X-ACTO esterilizado para cortar un pequeño trozo de tejido del centro de un lado de la tapa. Elija un lugar que esté lo más lejos posible de la superficie exterior del hongo. La Figura 3 muestra un hongo que fue muestreado.

6. Sostenga la muestra de tejido en el extremo de la herramienta de corte y vuelva a colocar la tapa sobre el hongo.

7. Con una mano, levante la tapa de una placa de PDA (pero deje que la tapa cuelgue sobre la superficie de agar para protegerla) y transfiera la muestra de tejido de la herramienta al centro de la superficie de agar y vuelva a colocar rápidamente la tapa. Una muestra de tejido más grande tiene más posibilidades de funcionar que una pequeña.

La inspección es crítica

Repita el proceso varias veces para aumentar la probabilidad de que al menos una de las placas produzca un micelio libre de contaminantes (micelio = colonia de hongos filamentosos). Incubar los cultivos en la oscuridad a temperatura ambiente. Examine los cultivos todos los días y deseche los que contengan bacterias o moho. Las hifas fúngicas (las células filamentosas delgadas de los hongos filamentosos) producen una colonia blanca floculenta que emana directamente de la muestra de tejido. El moho tiende a crecer más rápido y produce esporas de colores. Busque una pieza sólida de crecimiento fúngico de color blanco puro en la muestra y, después de unos días, se extenderá sobre la superficie del PDA. A veces crece el micelio del hongo, pero también se contamina. En este caso, a menudo es posible subcultivar el hongo hasta obtener un cultivo puro. Si hay poca o ninguna contaminación, pero no crece nada, los hongos son demasiado viejos y necesita un mejor material de partida.

tiempo de cultura

El micelio de hongos se puede mantener refrigerado en una placa de Petri de plástico o Parafilm® durante varios meses sin perder vitalidad.

La figura 4 muestra una placa de PDA con un pequeño trozo de tejido extraído de un hongo.

La Figura 5 muestra una cultura establecida. Una vez que tenga un cultivo puro, puede mantenerlo indefinidamente transfiriéndolo en serie a medios nuevos.

Se necesita mucho para cultivar hongos con éxito, pero una gran parte del éxito comienza con material no contaminado, y eso es lo que tendrás una vez que domines estas técnicas.

Lista de accesorios para el cultivo de tejidos fúngicos

Olla a presión / lata

placas de petri

Matraces Erlenmeyer con tapas o tapones (250, 500 ml)

Cilindro de medición (100, 500, 1000 ml)

Balanza de precisión (resolución de 0,1 g o superior)

medidor de pH

papas

Agar agar

Dextrosa (glucosa)

Extracto de levadura y/o peptona (opcional)

Bisturí o cuchillo X-ACTO

alcohol isopropílico al 70 %

Guantes de nitrilo

Bolsa de filtro de gasa o de malla fina

Lámpara de alcohol (opcional)